重金属离子（Fe3+、Cu2+、Zn2+和Cr3+）对沼气产量和生物甲烷生产的影响

摘要：结果表明，发酵培养基中重金属离子Fe 3+、Cu 2+、Cr 3+和Zn 2+的浓度影响沼气生产过程。本文的目的是确定离子浓度，从而提高沼气的产量和其中的甲烷含量。厌氧环境中不同浓度金属离子存在下牛粪发酵过程中单位干有机物沼气总产量、甲烷和沼气产量变化动力学。确定Fe 3+、Cu 2+的含量高达80 mg/dm 3、Cr 3+与未添加金属离子的样品相比，培养基中的Zn 2+高达 50 mg/dm 3 ，由于对酶系统活性的影响，导致微生物厌氧联合产生的甲烷增加。研究发现，提高牛粪发酵沼气中甲烷产量的合理浓度为：Fe 3+ -20 - 40 mg/dm 3、Cu 2+ -40 - 60 mg/dm 3、Cr 3+ -10 毫克/分米3. 金属离子浓度增加超过合理值导致沼气中甲烷含量降低。结果表明，锌离子对甲烷产生有积极影响，但会降低总沼气产量，从而降低有机原料的转化率。因此，发酵培养基中Zn 2+的合理浓度为10 mg/dm 3。

关键词

重金属,铁,锌,铜,铬,沼气,生物甲烷

一、简介

重金属离子 (Me + ) 对厌氧发酵过程的影响与进入发酵的原料（例如有机城市垃圾 [ 1 ]）中含金属化合物的含量不受控制有关，这可能导致通过以下机制抑制微生物的厌氧结合：

· 金属离子可与有机化合物的电子供体（羟基、羧基、氨基和巯基）基团相互作用，改变其结构，影响其生物作用[ 2 ]；

· 金属离子可以不可逆地取代酶系统活性中心和细胞其他成分的二价阳离子，导致微生物生长抑制和死亡[ 3 ]；

· 氧化金属——由于酶和细胞结构成分的不可逆氧化而对微生物产生不利影响[ 4 ]；

· 金属离子可以作为抗代谢物，使它们的分解代谢失活或加速它 [ 5 ]。

在厌氧过程中，在微生物复杂的厌氧结合的参与下，金属离子可以参与许多物理化学过程，包括以硫化物（Cr 3+除外）、碳酸盐和氢氧化物的形式沉淀；对厌氧系统固体的吸附；在溶液中与发酵过程中形成的中间代谢物、底物和产物形成复合物；与细菌等的细胞壁结合[ 6 ]。

铁在微生物厌氧结合的重要活动中的作用表现在酶组成中的生物作用：电子传递链，氢化酶，CO-脱氢酶，甲烷单加氧酶，NO-还原酶，超氧化物歧化酶，亚硝酸盐和硝酸盐还原酶，等[ 7 ]。

铁金属的生物利用度最被接受的机制与腐蚀有关：形成的 H 2可用于将厌氧发酵阶段的中间产物CO 2通过氢营养产甲烷菌还原为甲烷 [ 8 ]。

在环境中铁的积累过程中，微生物将金属包裹起来，从而破坏细胞结构。

铁 (III) 离子影响厌氧污泥的造粒，因为它们充当颗粒形成的中心，增加颗粒的直径并改善其粒度 [ 9 ]。

氧化铁 (II) 对微生物活性的抑制可能是由于其高浓度和随后的 pH 值造成的，这提供了与细菌发育不相容的条件 [ 10 ]。

Cu 2+是一种高电位氧化剂（Eo）（Cu 2+ /Cu 0 = +338 mV），能够取代酶活性中心的二价金属[ 11 ]。微生物可以将 Cu (II) 离子还原为 Cu (I) 和 Cu (0)（对于由 Cu (II) 形成的氧化还原系统，Cu (I) 的特点是标准电位值较低——+160 mV Cu 2+ /Cu +和 + 518 mV 对于 Cu + /Cu 0 ) [ 12 ]。

微生物严格调节细胞质Cu 2+的浓度以尽量减少其毒性作用，同时提供足量的含铜离子的蛋白质（Cu-蛋白质）。反过来，细菌中的铜蛋白是周质或细胞外的，而不是细胞质的 [ 11 ]。如果 Cu 2+含量对于微生物的生命活动来说太高，就会激活包含的细胞防御机制：Cue（Cu 外排）系统 [ 13 ]、CsoR（铜敏感操纵子）系统 [ 14 ]、Cu（ I) 获得毒性较小的离子Cu(II)[ 12 ]。

高浓度铜离子的产甲烷过程受环境中螯合剂的存在（在较高浓度下观察到抑制作用）、微生物密度（随着微生物浓度的增加——最大允许盐含量增加）等因素的影响。 )、pH（中性或微浸——允许铜离子浓度增加）、铁和铜离子的比值（铁离子含量越高，铜离子的抑制浓度值越高）。

Zn (II) 是影响磷酸盐、碳水化合物、蛋白质代谢、RNA 和核糖体合成以及调节细胞氧化还原电位的酶（氢化酶、甲酸脱氢酶、超氧化物歧化酶等）的组成部分，是膜成分的稳定剂，决定它们的反应性 [ 7 ] [ 15 ] [ 16 ]。不同类型微生物所需的最低锌离子浓度差异很大。

环境中锌离子的抑制含量——3 - 400 mg/dm 3，有毒——250 - 600 mg/dm 3取决于微生物种类和生活条件[ 17 ]。

Cr (III) 是葡萄糖、脂质和氨基酸代谢所需的重要微量元素，在微生物的复制和转录过程中起调节作用 [ 18 ] [ 19 ] [ 20 ]，但在高浓度时会引起负面影响关于细胞结构。由于化合物的氧化能力，Cr (VI) 的毒性和致突变性是 Cr (III) 的 1000 倍 [ 21 ]。当铬 (III) 蛋氨酸以 0.5 - 1.5 mmol/dm 3的浓度添加到培养基中时，会激活合成代谢过程、纤维素和淀粉分解活性，观察到微生物的细胞生长，结果它们的质量会增加 [ 22]。浓度高达 1.0 mmol/dm 3的氯化铬 (III)会增加细胞生物量的生长。将铬 (III) 盐的浓度增加到 2.5 mmol/dm 3会抑制水解过程和细胞生长。

在厌氧条件下，Cr (VI) 可以作为呼吸链中电子的最终受体，为广泛的电子供体，包括碳水化合物、蛋白质、脂肪、氢、NAD(F)N [ 23 ]，包括细胞质和膜在厌氧条件下，酶参与 Cr (VI) 的还原 [ 24 ]。

对于不同类型的厌氧微生物及其关联，环境中存在一系列对沼气生产没有不利影响的重金属离子：对于Fe 3+ -4 - 150 mg/dm 3，对于Cr 3+ -28 - 50 毫克/分米3；对于 Cu 2+ -0.3 - 5 mg/dm 3，对于 Zn 2+ -5 - 20 mg/dm 3。

该研究的目标是确定沼气和甲烷的产量对厌氧环境中 Me +离子浓度的依赖性。

2。材料和方法

2.1。微生物协会

作为研究的微生物协会，使用了一头奶牛的新鲜粪便制备的悬浮液（接种物），该奶牛以田间草为食。在制备悬浮液之前，确定了粪便的主要参数（表1）：干物质（DM）（GOST 26713-85 1986 [ 25 ]），干有机物质（DOM）（GOST 26712-94 1986 [ 26 ]），灰分 (A) (GOST 26714-85 1986 [ 27 ] )、pH 使用固定式实验室离子计 MI-150 (RF) 测定。为获得悬浮液，将 1 kg 粪便放入 5 升塑料瓶中并加入 3.6 dm 3蒸馏水。手动搅拌混合物并测定pH值（pH值范围应为6.5-7.5）。将瓶子置于恒温器 TC-80M（无照明，温度 37˚C ± 1˚C）中 60 天，定期排出瓶中形成的沼气，并以振荡运动搅拌培养基。60 天后，选择接种物测定 DM、DOM、A 和 pH（表 1）。

2.2. 金属离子厌氧发酵

为研究金属离子对厌氧发酵过程的影响，使用了容积为 1.0 dm 3的实验室甲烷罐，占用率为 70%，采用湿式储气罐。沼气池中 DOM 浓度为 8%。为此，将 300 克粪肥、200 毫升均质接种物和 200 毫升蒸馏水以及所需浓度的金属盐放入每个甲烷罐中（表 2）。搅拌混合物，测量pH（如果需要，用0.1 M NaOH或HCl调节至pH 7）。用草饲牛粪研究铁和铜离子的影响，用草饲牛粪研究铬和锌离子的影响。密封的甲烷罐

范围

牛粪

球菌

食物——草

食物——干草

Р, %

16.49 ± 0.82

17.04 ± 0.85

1.54±0.08

ОР, %

13.66±0.68

13.87 ± 0.69

1.00 ± 0.05

○, %

17.17±0.85

18.58 ± 0.92

14.71 ± 0.74

Н

7.2±0.36

7.1±0.35

7.7±0.39

表 1。原料和接种物的参数。

金属离子源

实验浓度，mg/dm3

Fe3+: FeCl3·6H2O

20, 40, 60, 80,

Cu2+: Cu(NO3)2·6H2O

10、20、40、60、80

Zn2+: ZnSO4·7H2O

10、20、50

Cr3+: Cr2(SO4)3·6H2O

10、20、35、50

表 2。厌氧系统中金属离子的浓度。

置于温度为 37°C ± 1°C 的恒温器中。每天搅拌培养基。在实验的解释期内记录沼气产量：含铁和铜离子的培养基为 22 天，含锌和铬离子的培养基为 13 天。

2.3. 沼气中的甲烷测量

在最大产量下测量沼气的定性成分：在研究铜离子、5-铁 (III)、10-锌离子和 8-铬 (III) 影响的第 7 天。沼气分析仪 SAZQ（中国）用于测量沼气中的甲烷。

3. 结果

3.1。铁离子的作用

不同浓度铁离子对牛粪发酵过程的影响见图1。作为实验的控制点，使用不含金属的样品。

3.2. 铜离子的影响

不同浓度铜离子对发酵过程的影响见图2。

3.3. 锌离子的作用

不同浓度Zn 2+对发酵过程的影响如图3所示。

3.4. Cr 3+的影响

不同浓度铬（ІІІ）对发酵过程的影响如图4所示。

4。讨论

如图1 （a）所示，Fe 3+对牛粪厌氧发酵中微生物的厌氧联合活性有积极影响。与未添加铁盐的样品相比，研究中的样品具有更高的沼气产量。在含有 40 和 60 mg/dm 3 Fe 3+的样品中，沼气在发酵当天开始形成。在 20 mg/dm 3 Fe 3+的含量下，从 2 天开始发生沼气形成。在80 mg/dm 3 Fe 3+的含量下，沼气的产率减慢。

如图1 (b)所示，在20 mg/dm 3 Fe 3+含量下，整个发酵期沼气的最高产量为4300 dm 3，为76.79±3.84 dm 3 /g DOM（图1 (c))，并且与对照样品中的沼气产量相比多 35%。当铁离子浓度增加到60 mg/dm 3时，沼气的产率和其中的甲烷含量降低。同时随着铁离子含量的增加，沼气中的甲烷含量降低（图1（b））。在这样的铁离子浓度下，沼气的产量比对照样品的产量高出 19.3%，达到 67.86 ± 3.39 dm 3的值/g DOM（图 1 (c)）。基于发酵 9 天后气体形成减少的事实，

图 1。(a) 不同浓度Fe 3+的沼气日产量(V) ；(b) 不同浓度Fe 3+发酵22天的沼气(V)和甲烷(V)总产量；(c) 每 1 克 DOM 发酵 22 天的总沼气产量。

图 2。(a) 不同浓度Cu 2+的沼气日产量(V) ；(b)不同Cu 2+浓度下发酵22天的沼气(V)和甲烷(V)的总产量；(с) 每 1 克 DOM 发酵 22 天的总沼气产量。

图 3。(a) 不同浓度Zn 2+的沼气日产量(V) ；(b) 不同浓度 Zn 2+下发酵 22 天的沼气 (V) 和甲烷 (V)总产量，(с) 每 1 克 DOM 发酵 13 天的总沼气产量。

图 4。(a) 不同Cr 3+浓度的沼气日产量(V)；(b) 在不同 Cr 3+浓度下发酵 22 天的沼气 (V) 和甲烷 (V)总产量，(с) 每 1 克 DOM 发酵 13 天的总沼气产量。

可以假设 Fe 3+对相关的产乙酸和产酸微生物有更积极的影响，因为它参与了多种酶：氢化酶（H 2的吸收或释放）、一氧化脱氢酶 (CODH)——一种酶厌氧菌形成乙酸[ 7 ]。含铁离子分别为 20 和 40 mg/dm 3的样品在 16 天和 20 天后沼气产量略有增加，这可能与使用氢和 CO 2形成甲烷的氢营养型产甲烷菌有关，因为铁离子浓度降低在发酵过程中由于生物量的增加。

如图2a所示，厌氧系统中40 mg/dm 3 Cu 2+的含量对沼气产量有积极影响。同时，Cu 2+ 40 和 60 mg/dm 3浓度的甲烷产率相同。即当铜离子含量增加到60mg/dm 3时，沼气中的甲烷浓度增加，达到83%。含量为 40 mg/dm 3铜离子中，甲烷的浓度为60%，其他浓度。基于沼气中甲烷含量增加而其产量降低的事实，可以假设这种铜离子浓度对微生物——氢消费者，它们包含在关联中具有负面影响，从而增加了从 CO 2产生的甲烷产量和氢气。这导致沼气中甲烷产量的增加和CO 2含量的降低。

铜离子（图2（b））在浓度为80 mg/dm 3时影响产甲烷微生物，沼气中的甲烷浓度开始降低，也降低了沼气的产量。Cu 2+ 10 mg/dm 3的浓度略微提高了沼气产量（图2（b）），但对沼气中的甲烷产量有积极影响（图2（b））。我们获得了对沼气和生物甲烷产量的刺激作用，而不是预期的抑制作用，这可以通过与原料中含有的环境成分和系统中高浓度的微生物和足够的铜蛋白形成复杂的铜化合物来解释[ 11 ]。

对铜的一般抗性的另一个机制是厌氧联合的多样性，这可以通过与硫酸盐还原菌Desulfotomaculum spp共培养时对嗜热自养甲烷杆菌缺乏抑制作用来证明。培养基中 Cu 2+浓度为 63.5 mg/dm 3时，可完全抑制嗜热自养甲烷杆菌[ 28 ]。在这种情况下，部分硫化氢与环境中的金属离子发生反应，形成金属硫化物，因此对微生物的抑制作用降低[ 29 ]。脱硫弧菌菌株R2 对 800 mg/dm 3 Cu 2+具有抗性，因为它含有抗 Cu 2+的质粒基因[ 30 ]。产甲烷菌中超氧化物歧化酶 (SODM) 和氢化酶中的铜离子含量 [ 31 ] 也可能影响抑制的缺乏。

鉴于获得的数据，可以考虑 Cu 2+ 20…80 mg/dm 3的浓度范围将沼气产量从 56.88 dm 3 /g DOM（对照）提高到 114.29 dm 3 /g DOM（图 2 (c))，可用于生产沼气厂的微量营养素。

图3（a）表明，添加Zn 2+并不会刺激微生物厌氧联合产生沼气，即使在最低浓度（10 mg/dm 3）下，沼气产量也从80.36 dm 3 /g DOM（对照样品）至 74.11 dm 3 /g DOM，（图 3 (c)）。这证实了锌离子在环境中浓度为 3 mg/dm 3时对微生物的抑制作用[ 17 ]。在这种情况下，沼气中的甲烷含量从对照中的 56% 增加到锌浓度为 10 mg/dm 3时的 72% （图 3 (b)）。浓度为 20 和 50 mg/dm 3发酵 13 天具有相同的沼气产量（图 3（b）），但在 20 mg/dm 3时，甲烷产量略高于 50 mg/dm 3时（图 3（b））。另外值得注意的是，锌离子的作用使沼气中的H 2含量增加，达到7%～10%，这表明锌离子对产氢微生物具有积极作用。

如图 4 (a)所示，Cr 3+对包括产甲烷菌在内的微生物群的活性具有刺激作用，这表现为所有含铬盐的测试样品在 8-10 天内达到峰值沼气产量。同时，沼气产量的峰值几乎是对照样品值的两倍。这证实了Cr(III)参与了有机化合物的代谢，可以促进微生物细胞的生长，从而提高其生产力[ 22 ]。

随着铬盐的添加，甲烷产量也会增加（图 4 (b)）：如果对照样品沼气中的甲烷含量为 56%，那么测试样品的甲烷含量不低于 68%。图4 (b)和图4 (c)显示，浓度为10 mg/dm 3的沼气产量比对照值高37.8%，比20-50 mg浓度范围内的沼气产量高5% /分米3。但是增加铬离子的浓度，尽管在这个浓度范围内的沼气产量相同，但会导致甲烷含量从 20 mg/dm 3 的 70% 降低到50 mg/dm 3的 68% 。

5。结论

结果表明，Fe 3+、Cu 2+、Cr 3 +等金属离子对沼气产率和沼气含量有积极影响。由于对酶系统活性的影响，所有实验浓度的 Fe 3+、Cu 2+、Cr 3+和 Zn 2+离子通过微生物的厌氧结合导致甲烷产生增加。

提高沼气中甲烷产量的合理浓度为：Fe 3+ -20 - 40 mg/dm 3、Cu 2+ -40 - 60 mg/dm 3、Cr 3+ -10 mg/dm 3。锌离子对甲烷产生有积极影响，但会降低沼气的总产量，从而降低有机原料的转化率。因此，Zn 2+的合理浓度为10 mg/dm 3。

作者贡献

所有作者都对研究的概念和设计做出了贡献。NB Golub、MV Kozlovets 执行的实验计划。由 AV Shynkarchuk, OA Kozlovets 进行材料准备和实验室安装施工。实验，数据收集由 AV Shynkarchuk, OA Kozlovets 进行。数据分析由 MV Kozlovets, NB Golub 进行。手稿的初稿由 AV Shynkarchuk 撰写，所有作者都评论了手稿的先前版本。所有作者阅读并认可的终稿。

致谢

作者感谢 Igor Levtun 在撰写本手稿时提供的技术援助。

利益冲突

作者声明与本文的发表没有利益冲突。

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