利用PCR和Southern Blot鉴定转化拟南芥的转基因DNA

摘要：拟南芥植物材料转基因DNA的鉴定方法如下：将种子漂白或灭菌后转化生长，然后用聚合酶链反应离子（ PCR ）扩增基因，然后进行凝胶电泳。准备好进行Southern印迹分析，这种方法是可能的，因为给定引物的长度，在方法中略有修改，如连接PCR技术开发用于在提取未知DNA后扩增未知DNA以确定其转基因性。这些方法对来自转基因和非转基因细胞系的许多不同植物具有特异性和可重复性。此外，PCR结果的产物数量可以被认为是对转基因DNA的良好估计，在与Southern印迹分析比较期间，PCR获得的结果提供了有关拟南芥DNA的信息，该方法在拟南芥植物转化后的应用将描述农杆菌介导的转化。

关键词

.拟南芥, Southern Blot ,聚合酶链反应,农杆菌,引物

一、简介

拟南芥是十字花科或十字花科的植物，它是与白芥和黑芥相关的开花植物之一，这种植物是研究植物生物学的理想植物，因为研究的第一个完整序列是这种植物的种子，以获得完整的基因组 [ 1 ]。

农杆菌是一种用于基因转移的革兰氏阴性细菌，因为它具有在其他植物、真菌和自身之间转移 DNA 的能力，因此它是植物基因工程通过转化改良植物的重要工具 [ 2 ]，该基因是与植物（例如拟南芥）重组，然后在存在合适的标记物 [ 3 ] 的情况下使用植物载体转化进行克隆，该标记物具有抗生素抗性，用于最佳选择成功转化的植物，在转化后在含有抗生素的培养基中生长 [ 4 ] [ 5 ]。

用于通过农杆菌转化获得转基因拟南芥植物的方法和分析程序导致在植物染色体的不同位置产生不同数量的DNA拷贝，这些拷贝会影响基因表达的稳定性和水平，因此鉴定应该对转基因进行熟悉的转基因表达水平分析，这应该是独特的程序 [ 6 ]。

在本报告中，种子（T1代）将使用从经过农杆菌介导的转化的拟南芥植物中获得的N70756菌株，在提取植物基因组DNA后，将使用基于PCR的方法和Southern印迹进行检测、分析和筛选转基因在植物中，Southern 印迹分析是鉴定转基因 DNA 和拷贝数最常用的方法 [ 7 ]。尽管结果准确，但它是一种费力且耗时的方法，尤其是在分析许多样品时，并且会消耗基因组 DNA 的重要部分 [ 8 ]。

以转基因作为快速检测转基因 DNA 的 PCR 方法，筛选方法是根据提取的 DNA 的长度差异对适合靶向的引物序列进行扩增，称为互补引物扩增 [ 9 ]，这种方法可以导致到不需要的和非特异性扩增的不良背景 [ 10 ]。修改后的技术将允许对大量样本进行快速分析，以克服传统方法的缺点。

2。材料和方法

2.1。使用固体培养基在无菌条件下生长植物

拟南芥应使用固体培养基在严格无菌条件下生长，以用于实验目的，例如选择抗药性和转化植物，检查幼芽和根的表型以及确定植物的纯合致死突变体。将使用用于灭菌种子系的液体漂白剂。

将用作植物生长容器的材料是直径为10厘米的无菌培养皿，根据实验的需要用于培养的品红色盒子或管以及用于灭菌的高压灭菌器。

使用的试剂是 Murashige 和 Skoog (MS) 基础盐混合物、蔗糖、2-(N-吗啉代) 乙磺酸 (MES)、蒸馏水、氢氧化钾 (KOH)、粒状琼脂。

在装有 200 ml 蒸馏水的烧杯中加入 1.075 g (MS) 基础盐混合物、2.5 g 蔗糖和 0.125 g (MES)，搅拌均匀，然后再次加入蒸馏水直至达到 250 ml 的最终体积，加入 2.5 蔗糖使用它代表最终体积 250 ml 的 1% 作为植物在培养基上快速生长的营养物，但应使用种子消毒作为液体漂白消毒来避免真菌和细菌生长。

使用 PH 计使用 1 M KOH 将溶液的 PH 调整到 5.7，并称取 250 g 粒状琼脂并每瓶添加，但为下一步保持瓶盖松动，以免因压力差而爆炸。

将瓶子在 121°C 下用搅拌磁铁高压灭菌 20 分钟以进行灭菌，然后将瓶子放在低速搅拌板上，然后点燃琼脂培养基冷却，直到可以徒手握住，并使用永久性标签在培养皿底部带有识别号 (N70756)、名称和日期的标记 将足够的培养基倒入 4 个板中，直到覆盖大约板深度的一半并将板在室温下冷却约 1 小时以使琼脂凝固。

2.2. 种子灭菌

我们将使用微型离心管和试剂作为容器用于消毒的家用漂白剂、蒸馏水和拟南芥种子。

使用微型离心管通过将种子浸泡在 50% 家用漂白剂中对种子进行消毒，然后在蒸馏水中冲洗离心管 5 到 7 次以去除所有漂白剂残留物。

2.3. 播种

我们将使用移液器进行抽吸和分配以及微孔胶带。

通过吸力将每个单独的种子粘附到移液器尖端以低密度种植种子，然后使用移液器尖端将其释放到任何位置的含有琼脂的板中，以进行分配和吸力以去除多余的水，然后点燃顶部的水琼脂干燥，然后再盖上盖子。

在盘子周围使用微孔胶带以避免干燥，同时允许轻微通气并将盘子在 4°C 中放置 1 天，以进行分层，打破种子休眠。也许对许多系来说并不重要，但最好让这些系以均匀的方式正常发芽，或者在将它们置于低温下 1 至 5 天一次的情况下同步发芽，然后将这些板转移到生长环境中，然后照射120 - 150 µmol/m 2 sec 连续光照和 22˚C - 23˚C 的温度，以提供合适的生长条件，作为对植物的太阳效应的模拟器。

2.4. 从转基因拟南芥幼苗植物中提取 DNA

本步骤将使用 Isolate II 植物 DNA Kit-bio line，所用试剂为 AP1 Buffer、拟南芥苗叶、RNase A 原液、结合缓冲液 (PB)、洗涤缓冲液 PAW1、洗涤缓冲液 PAW2 和洗脱缓冲液。

容器和装置是水浴、1.5 ml Eppendorf 管、天平、Eppendorf 杵、Isolate II 过滤器（紫色）、ISOLATE II 植物 DNA 离心柱（绿色）和硅胶膜。

将水浴调节至 65˚C，将等分的 AP1 缓冲液放入水浴中加热，然后从拟南芥 幼苗中取一或两片叶子来自不同的两个样品 A 和 B 并将每个样品的叶子放入单独的 Eppendorf 管中，然后使用手术刀或 Eppendorf 杵将它们切成非常小的碎片 将圆底 1.5 ml 管放在天平上，去皮并添加植物材料并称重，重复此过程直至达到 0.1 g，然后加入 400 µl 缓冲液 PA1 和 10 µl RNase A 储备溶液并使用 Eppendorf 杵破坏组织，直到缓冲液呈绿色，然后在高压灭菌器中孵育混合物，倒置管 2 -孵育期间混合 3 次，然后以 11,000 rpm 的速度将裂解物离心 5 分钟，然后将紫色 Isolate II 过滤器放入干净的 2 m 收集管中，并将裂解物加入柱中，仅将上清液放入紫色过滤管中。

注意：您可以剪掉所需数量的 p 1000 过滤器吸头的最后 5 毫米，在末端打出一个更大的孔，将裂解液移入离心柱以吸收所有液体，或者您可以直接从您的 Eppendorf 管，您还可以转移一些植物材料。

以 11,000 rpm 的速度将管子离心 2 分钟，然后取下 ISOLATE II 过滤器并收集清澈的流出液。

注意：如果观察到流过的颗粒，将上清液转移到新的 1.5 ml 微量离心管中，不要干扰颗粒。

添加 450 µl 结合缓冲液 (PB) 并通过涡旋充分混合并将 ISOLATE II 植物 DNA 绿色离心柱放入新的 2 ml 收集管中并添加 700 µl 样品，然后以 11,000 rpm 离心 1 分钟并丢弃向下流动的-之后加入 400 µl 洗涤缓冲液 PAW1，然后以 11,000 rpm 的转速离心 1 分钟，然后再次丢弃流出液。

加入 700 µl 洗涤缓冲液 PAW2，然后以 11,000 rpm 离心 1 分钟，然后弃掉流出液，加入 200 µl 洗涤缓冲液 PAW2，这次以 11,000 rpm 离心 2 分钟以弃去洗涤缓冲液并完成干燥的硅胶膜，然后转移将 ISOLATE II Plant DNA Spin Column 移至新的 1.5 ml 微量离心管中。

将先前在高压釜中加热的 50 µl 洗脱缓冲液 PG 添加到膜的中心。最后以 11,000 rpm 离心 1 分钟。

注意：标记 DNA 样本并将其存放在冰箱中。

原理 PCR 方案：

应完成预混液，而不是将每个组分单独移液到单独的管中，根据等式 n + 1 进行计算，其中 n 表示反应管的数量，允许额外的管以确保预混液足以移液到每个反应管，因此 PCR 预混液如表 1所示。

底漆套装 1：

前锋：GGATCTTGAAGGAATTGAAG

反向：ATCGTTGCCTGCCAGTGAAAC

PCR 的热循环条件为：94˚C 变性约 15 秒，

模板 DNA

底漆套装 1

底漆套装 2

样品

管从 1 到 4

管从 1 到 4

阳性对照

管 5

管 5

阴性对照

管 6

管 6

无模板控制

7号管

7号管

表 1。样品引物组 1 和引物组 2 管的含量、阳性对照、阴性对照和无模板对照。

60°C 退火约 30 秒，72°C 延伸约 30 秒，然后最终延伸 72°C 约 120 秒。

底漆套装 2：

前锋：TAGAAACCCCAACCCGTGAAATC

反向：CAATGCTGATCAATTCCACAGTT

PCR 的热循环条件为：94°C 变性约 15 秒，62°C 退火约 30 秒，72°C 延伸约 30 秒，最后 72°C 延伸约 120 秒。

用无 DNA 的阳性转基因样品、阴性转基因样品和阴性对照 PCR 4 个样品制备 PCR。

计算每个组分的数量以获得所需的浓度，为 8 个反应的每个组分制备最终预混液，但不为 DNA 依法制备：

C最初的*五最初的=C最后*五最后然后乘以 8

其中C是浓度，V是体积。

计算结果如表2所示。

所以主混音将包括：

100 µl 红色混合物

4 µl 正向引物

4 µl 反向引物

84 µl 蒸馏水

准备 10 个微管

A1 B1 +ve -ve N

A2 B2 +ve -ve N

将 DNA 样本 1 放入 A1 和 A2。

将 DNA 样本 2 放入 B1 和 B2。

在每管中加入 24 µl 预混液，然后将它们放入 PCR 中。

凝胶电泳方案：

在此凝胶电泳中，将制备 TBE，它是用于制备凝胶的缓冲液，如表 3所示，因此首先制备 500 ml TBE，它是 Tris 碱 + 硼酸 + EDTA 混合物的缩写。

使用装满蒸馏水的 500 毫升瓶，称量试剂并溶解它们，然后使用搅拌磁铁将它们混合。

试剂

最初的

专注

最后

专注

数量（微升）

1个反应

8 次反应的数量 (µl)

（每个引物组的主混合物）

红色混合

2×

1×

12.5 微升

100 微升

正向引物

10微米

0.2 µM

0.5 微升

4微升

反向底漆

10微米

0.2 µM

0.5 微升

4微升

模板 DNA

-

-

1微升

-

蒸馏水

-

-

10.5 微升

84 微升

全部的

-

-

25微升

192 微升

表 2。在制作含有红色混合物、正向引物、反向引物、模板 DNA 和蒸馏水的试剂的预混液后，通过微量管的数量和浓度。

试剂

数量

三碱基

5.4 克

硼酸

2.75 克

乙二胺四乙酸

0.292 克

蒸馏水

500 毫升

表 3。用于制备凝胶电泳的试剂的主要成分和数量。Tris 碱、硼酸、乙二胺四乙酸 (EDTA) 和蒸馏水。

称取 2 g 琼脂糖并从 TBE 溶液中倒入直至达到 100 ml，然后使用微波将其溶解，直到溶液变得澄清均匀，然后加入约 10 µl SYBR 安全 DNA 染料。

将凝胶倒入模具中，不要取下梳子，让它凝固。

凝固后倒入一些 TBE 并轻轻取出梳子，然后吸取 10 µl 每个孔，如表 4 所示。

南方印迹协议：

将铸件连接到电源（黑线为负极，红色为正极），使电流在 110 V 下运行约 20 分钟，然后将铸件放入南部印迹中。

3. 结果

3.1。植物播种

用 1% 蔗糖处理种子后，如图 1所示，在 6 天内已长出小芽。

3.2. 转基因拟南芥的鉴定

PCR后进行Southern印迹分析，未显示拟南芥系的转基因DNA数据。

图 1。拟南芥N70756 的芽，

图 2。在 PCR 上加载的样品；上管 N：无模板对照，A1：样品 A拟南芥的 DNA ；(B1)：样品B拟南芥的DNA ；(+)：阳性对照；(-)：阴性对照；下管 N：无模板对照；A2：样品A拟南芥的DNA ；B2：样品B拟南芥的DNA ；(+)：阳性对照；(-)：阴性对照。

出色地

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

内容

A1

B1

+ve

-ve

新台币

A2

B2

+ve

-ve

新台币

梯子

表 4。将填充以用于 Southern 印迹分析的孔方案，样品 A1，样品 B1，阳性对照，阴性对照，无模板，样品 A2，样品 B2，阳性对照，阴性对照，无模板和梯子。

3.3. 转基因拟南芥的Southern印迹分析

使用Southern印迹分析了几个水平的转基因或非转基因拟南芥细胞系，如图2和图3所示的结果显示除梯子外没有转基因细胞系，这可能表明移液错误或预测DNA样品A和B都不是转基因的[ 11 ] 因为 DNA 可能不会在两个样本中提取。

图 3。PCR 扩增产物和从转基因 A 和 B DNA 样品中获得的 PCR 扩增产物凝胶电泳后的 DNA 印迹分析。泳道 1 (A1)：样品 A拟南芥的 DNA ；泳道 2 (B1)：样品 B拟南芥的 DNA ；泳道 3 (+ve)：阳性对照；泳道 4 (-ve)：阴性对照；泳道 5 (N1)：无模板对照；泳道7（A2）：样品A拟南芥的DNA ；泳道 8 (B2)：样品 B拟南芥的 DNA ；泳道 9 (+ve)：阳性对照；泳道 10 (-ve)：阴性对照；泳道 10 (N2)：无模板对照；泳道 16 (L)：分子标记 1 kb 加 DNA Ladder (Life Technologies)。

阳性和阴性对照显示基因的低表达。

4。讨论

根据协议，给定的引物组有2个，它们是针对拟南芥的DNA序列，每个引物组由正向链和反向链组成，引物组1序列为：

前锋：GGATCTTGAAGGAATTGAAG

反向：ATCGTTGCCTGCCAGTGAAAC

引物组 2 序列为：

前锋：TAGAAACCCCAACCCGTGAAATC

反向：CAATGCTGATCAATTCCACAGTT

通过使用 The Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 查找这些引物之间的相似性，比较核苷酸序列数据库并在拟南芥上调整它们，在引物组 1 中找到的目标序列用于确定 DNA 提取，它类似于拟南芥泛素-结合酶 10 (UBC10)，mRNA，其序列为

GTTAAAAGTAGAGTCCACTAGTCAAAGAAAGTAAATAATCCACACGGTATTTATTGTAGACGTGAGCACA

GAGAATAATTCGTATTCTTCGTCTTTCGTCCACCACCATCTCTATTTTCTTCCTTTCCCCTAAGTCTTGG

TTCTTCTTCTCTCTAATACGAGAAGAAAAAGGCGAAAACCTCGCCAATCCGATTACGCGAAAAATCAAAG

GTTTTTGGATATGGCGTCGAAGCGGATCTTGAAGGAATTGAAGGATCTCCAGAAGGATCCACCTACATCA

TGTAGCGCAGGTCCTGTTGCTGAAGACATGTTTCACTGGCAGGCAACGATAATGGGTCCTTCAGAGAGTC

CTTATGCTGGAGGTGTTTTCCTTGTAACCATCCATTTCCCTCCGGATTACCCATTCAAGCCTCCTAAGGT

GGCCTTTAGGACCAAGGTGTTCCATCCCAACATTAACAGCAACGGTAGCATTTGCCTCGACATCTTGAAG

GAGCAGTGGAGTCCTGCGCTCACCATTTCCAAGGTGCTGCTATCGATCTGTTCTTTGTTAACCGATCCAA

ACCCGGATGATCCTTTGGTGCCCGAGATAGCTCACATGTACAAGACTGACAAGAACAAGTACGAGTCCAC

TGCACGAAGCTGGACTCAGAAGTATGCCATGGGCTAAATGGAAAATCCCACCTACTAAATTATCTCTTTA

TGAAGAAAAAAATCTGCCTTAATTTCTATGTATGATTCGATAGACATCTCTTTGTGTCCTTTTAACTTTC

TGAAGACAGGACCAAATGAAGTGGGTCTTGTTTTAAACGAAACAAAAAAAAACATCATCTTTGTGAAAAC

TAGAATCTGATCATCTTCTGTTGTTTCTTCTTGTGGTGAAATTATGATTTGATGTTTTCGTTGTGTGATG

AGTTGCTACGAGTTGTTCAAATTTATCAAACTAGTCTTCAAACTTATCCAACTGGTCTTCAAACTTATCC

AACTGGTCTTCAAATTACTCTGAGTTAATCGTTGTGGCCA

选择该目标序列是因为它与具有 100% 同一性的引物组 1 的序列相似。

在引物组2中发现的目标序列是用于确定DNA转基因性，它类似于拟南芥转基因系M57 T-DNA标记的转录起始位点，部分序列和β葡萄糖醛酸酶mRNA，部分cds，其序列为

CACACGATTTATTAAACGCTGCACTTGGCTAGAACTAGTGGATCCCCGGGTAGGTCAGTCCCTTATGTTA

CGTCCTGTAGAAACCCCAACCCGTGAAATCAAAAAACTCGACGGCCTGTGGGCATTCAGTCTGGATCGCG

AAAACTGTGGAATTGGTCAGCGTTGGTGGGAAAGCGCGTTACAAGAAAGCCGGGCAATTGCTGTGCCAGG

CAGTTTTAACGATCAGTTCGCCGATGCAGATATTCGTAATTATGCGGGCAACGTCTGGTATCAGCGCGAA

GTCTTTATACCGAAAGGTTGGGCAGGCCAGCGTATCGTGCTGCGTTTCGATGCGGTCA

该目标序列也已被选择，因为它与引物组 2 的序列相似，具有 100% 的同一性。

因此，引物组 2 将用于鉴定拟南芥的转基因品系，通常还有许多其他的检测方法可用于检查转基因品系中报告基因的存在，如荧光测定和组织化学测定 [ 12 ]。

另一种对植物非常特异的方法是 GUS 测定法，它主要依赖于使用β-葡萄糖醛酸酶，它是通过将单个细胞染成蓝色而不使用任何复杂技术来检测单细胞的完美方法，该方法的主要缺点是细胞在这种方法中被杀死，但这种方法在植物科学中非常流行 [ 13 ]。

尽管由于使用 1% 蔗糖，植物播种非常成功，但 Southern 印迹没有显示任何结果，这可能是由于移液错误或由于两个样品中没有转基因 DNA 或 DNA 降解导致结果为阴性。

另一种可能性可能是因为 DNA 没有被提取，因为结果显示该基因的低表达。

5。结论

总之，转基因拟南芥物种过表达可以使用PCR和Southern印迹分析来检测转基因DNA，并使用作为DNA靶序列的引物来确定合适的细胞系，尽管PCR适用于定量DNA尤其是植物含有高拷贝数。

在这些实验中，根据Southern印迹分析，转基因植物含有不止一个转基因拷贝，因此未来可以做进一步的实验来检测与拷贝数相关的转基因，因此根据结果，使用PCR和使用PCR不匹配。南方印迹分析。

结果表明，未满足转基因拟南芥的所需检测可能是由于移液问题或由于造成和干扰结果的污染，这种干扰太低而无法确定样品不是转基因的，并且使用引物组将使用 BLAST 服务器有助于此测定，因此如果 PCR 效果较低 [ 14 ] ，则可以确定。

DNA可能无法很好地提取，基因的表达非常低。

污染和干扰不容易避免，特别是在使用基于农杆菌的方法转化拟南芥时，可重现性以提供正确的结果，在使用农杆菌程序转化拟南芥的实验室中，Southern 印迹分析技术是转基因测定的选择 [ 15 ]。

未来可以使用非常特殊的方法进行进一步的研究，例如 GUS、依赖于植物组织培养的组织化学测定以及可被视为转基因基因标记的荧光测定。

利益冲突

作者声明与本文的发表没有利益冲突。

参考

[ 1 ] 第一种在太空中开花的植物。吉尼斯世界纪录。

[ 2 ] Leuzinger, K., Dent, M., Hurtado, J., Stahnke, J., Lai, H., Zhou, X. 和 Chen, Q. (2013) Efficient Agroinfiltration of Plants for High-Level Transient Expression of Recombinant Proteins . 可视化实验杂志，77，e50521。

[ 3 ] Schell, J. 和 Van Montagu, M. (1977) 根癌农杆菌的 Ti 质粒，一种用于在植物中引入 NIF 基因的天然载体？在：Hollaender, A., Burris, RH, Day, PR, Hardy, RW, Helinski, DR, Lamborg, MR, Owens, L. 和 Valentine, RC, Eds.，固氮基因工程。基础生命科学，Springer，波士顿，159-179。

[ 4 ] Joos, H.、Timmerman, B.、Montagu, MV 和 Schell, J. (1983) 植物细胞中农杆菌 DNA 转移和稳定的遗传分析。EMBO 杂志，2，2151-2160。

[ 5 ] Thomson, JA (2016) 植物基因工程。生物技术，3, 7 页。

[ 6 ] Arnold, C. 和 Hodgson, IJ (1991) Vectorette PCR：基因组步行的新方法。基因组研究，1, 39-42。

[ 7 ] Hobbs, SL, Warkentin, TD 和 DeLong, CM (1993) 转基因拷贝数可以与转基因表达正或负相关。植物分子生物学，21、17-26。