选择性胃肠微生物对狭柄隐孢子虫体外代谢产物结肠产生的影响

在人类营养中，膳食纤维不能被哺乳动物酶降解，因此有可能被生活在胃肠道中的微生物发酵。人们认为，这些可发酵的碳水化合物通过刺激特定细菌种类的生长或新陈代谢来影响发酵，这可能对健康有益。因此，在这项研究中，三种肠道相关微生物——大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌被用于发酵 Otili的不可消化部分——Sphenostylis stenocarpa，一种成熟的未充分利用的野豆，具有很高的经济重要性。发酵 18 小时后，通过 GC-MS 分析检测和评估短链脂肪酸 (SCFA) 和中链脂肪酸 (MCFA)。代谢产物相对依赖发酵罐。本研究确认丁酸是发酵 18 小时后的主要 SCFA。还探讨了检测和量化的 13 种其他 MCFA 的临床意义，从而赋予Otili一种有价值的益生元。

关键词

难消化部分,膳食纤维,发酵,短链脂肪酸,中链脂肪酸

一、简介

大多数食物在提供营养和能量以维持日常生活方面被认为是功能性的，但能够预防或补救压力或疾病状态的饮食系统被归类为功能性食品 [ 1 ]。非洲山药豆或 Sphenostylis stenocarpa 当地称为 Otili 属于豆科植物，其特点是果实（豆科植物）和规定的叶子。未充分开发的物种是非洲重要的食物来源，种子通常添加到汤中、制成酱汁或研磨成面粉 [ 2 ] [ 3 ]。它们生长在喀麦隆、科特迪瓦、加纳、尼日利亚和多哥等西非国家 [ 4 ] [ 5] . 它像藤蔓一样长到大约 3 m 的高度，并在 100-150 天内开出鲜艳的花朵 [ 2 ] [ 6 ]。山药豆是许多非洲社区的有用营养来源，其营养价值可与大豆媲美，尽管山药豆的烹饪时间要长得多 [ 7 ] [ 8 ]。然而，已经发现一些与食用这种豆有关的健康问题，包括胀气、胃痉挛、腹泻和头晕 [ 5 ] [ 9 ]。尽管有一些关于普通食用豆的保护作用的建议，但流行病学研究通常不足以得出普通食用豆降低这些疾病风险的结论 [ 10] [ 11 ] [ 12 ]。他们得出的结论是，它们是可能具有重要代谢和/或生理作用的少量化合物的良好来源。

迄今为止，我们所做的一些研究包括评估 Otili-野豆的功能特性、营养品质和清除能力 [ 13 ] [ 14 ] [ 15] . 数据提供了初步证据，表明尼日利亚野生 Otili（Sphenostylis stenocarpa）等豆类饮食的消费在生物活性化合物成分方面与普通食用豆菜豆相竞争。所提供的知识有助于指导参与品种选择的研究人员的工作，并减少或消除抗营养因素，使不可食用的野豆种子作为廉价的蛋白质来源更容易被接受。同样在我们之前的研究中，与普通食用豆类相比，Otili 对由葡聚糖硫酸钠 (DSS) 诱导的结肠癌细胞增殖的抵抗能力高于普通食用豆类 [ 16 ]。

尽管有上述所有这些发现，但这种未被充分利用的野生豆仍然被认为是一种孤儿作物，在改善食品的数量和质量方面具有巨大的未开发潜力。在人类营养中，膳食纤维不能被哺乳动物酶降解，因此有可能被生活在 GIT（人类，主要是结肠）中的微生物发酵。一些肠道菌群与人类之间的关系不仅是共生的（一种无害的共存），而是一种互惠的关系 [ 17] . 一些人类肠道微生物通过将膳食纤维发酵成短链脂肪酸 (SCFA) 和中链脂肪酸 (MCFA) 来使宿主受益。微生物代谢终产物占人体血液中代谢物的三分之一，在肠道稳态中发挥重要作用，并对宿主代谢和健康产生影响 [ 18 ] [ 19 ] [ 20 ]。因此，我们目前的研究旨在检查肠道相关微生物发酵后形成的代谢产物，以深入了解这种未充分利用的野豆的化学预防活性背后的有机产物。

二、材料与方法

2.1。栽培品种培养基制备的收集

本作品中使用的豆类（豆类）是从 Ado-Ekiti 的农民那里获得的野生型豆 - Sphenostyles stenocarp（Otili 非洲山药豆）。使用的媒体是；营养琼脂、MRS 琼脂、蛋白胨水。将15克蛋白胨粉溶于1000毫升蒸馏水中，制成蛋白胨水。将 5 克营养琼脂溶解在 178.6 毫升蒸馏水中。将5克MRS琼脂溶解在75毫升蒸馏水中制备MRS琼脂。然后将培养基在 121˚C、15 帕斯卡的高压灭菌器中灭菌 15 分钟。还制备了营养琼脂斜面以储存用过的生物。

2.2. 非消化部分的提取

Shimin 等人 描述的碱催化水解方法。[ 21] 用于从豆类样品中提取不溶性膳食纤维。通过使用搅拌机粉碎制备豆样品。将 20 克每个样品一式四份放入不同的烧杯中，然后向每个样品中加入 25 毫升乙酸乙酯。3小时后，将浆料用水洗涤并在55°C的热空气中干燥过夜。以浆液体积的 20 倍加入氢氧化钠，然后将混合物以 4000 rpm 离心 15 分钟。然后将收集的物质沉积并用水洗涤。用 76% 乙醇、95% 乙醇和 4 倍浆液体积的丙酮洗涤沉淀物后，从残留物中回收不溶性膳食纤维，并在 55°C 下用热空气干燥过夜。最终豆类样品提取物中的不溶性膳食纤维含量约为 40%，而其他 60% 的提取物是无氮提取物 (NFE)。IDF含量按GB 5009.88-2014测定。

2.3. 生物分离

使用 MRS 琼脂从新鲜牛奶中分离出嗜酸乳杆菌。使用的其他微生物大肠杆菌和枯草芽孢杆菌获自埃基蒂州立大学微生物学实验室，Ado Ekiti。将储备液中的一环分配到 9 ml 蒸馏水中并以 10 - 1至 10 -7的稀释度连续稀释。然后将一环接种到 MRS 琼脂、营养琼脂和蛋白胨水中。将纯培养物中的一株接种到营养斜面中保存。

2.4. 体外胃肠发酵

从豆中分离的总难消化部分的体外结肠发酵在用蛋白胨水制备的一次性试管中在严格的厌氧条件下发酵，在 37°C 下进行轻微修改，如 Campos-Vega 等人所述，[ 12] . 用 0.1 mol/L、Ph 7 磷酸盐缓冲液按 1:10 (w/v) 稀释选定的胃肠道微生物（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌），并在数字高速匀浆器系统（IKA-Ultra -Turrax，T18，美国；1 分钟，7847 g)。将得到的悬浮液（1 ml）分布在一次性试管（含有 9 ml 蛋白胨水）中，并加入 0.1 g 从每个豆中分离的总难消化部分。所有温育均一式三份进行。在室温下将每个管与100μl氢氧化钠混合以停止反应。每次发酵获得的试管在 4°C 下以 35,009 g 离心（Hermle Z 323 K；Wehingen，Germany）15 分钟。在分析代谢物谱之前，上清液处于-80˚C。

2.5. 气相色谱-质谱 (Gc-Ms) 分析

使用配备 DB-5MS 毛细管柱（60 m 9250 lm 90.25 lm；Agilent 7890A 气相色谱仪）的 Agilent 5975C VL 质量选择检测器分析挥发性成分）。氦气（流速，1 ml/min）用作载气。注射器温度为 250°C。烘箱温度程序为 40°C 5 分钟，以 5°C/分钟增加至 200°C 并保持 2 分钟，然后以 20°C/分钟增加至 230°C 并保持 15 分钟。在电子碰撞 (EI) 电离模式下以 70 Ev 记录质谱。四极杆质量检测器和离子源的温度分别为 150˚C 和 230˚C。进样器用于不分流模式。使用乙酸、丙酸和丁酸 (Sigma-Aldrich) 的标准曲线对 SCFA 进行量化。通过将样品的质谱与数据系统库 MSD Chem Station 软件（Agilent G1701EA 版本 E.02.00.493）进行比较，对挥发性成分进行初步鉴定。计算所有发酵代谢物的相对浓度，以乙酸作为参考，表示不同代谢物的相对比例，结果以 µg/ml 表示。

3。结果与讨论

发酵是微生物对食物，特别是碳水化合物的酶促分解和利用。它发生在所有动物的胃肠道中，但发酵的强度和产物取决于微生物的数量和类型，通常在大肠中最高 [ 22 ]。由活微生物的酶引起的食物化学变化构成发酵。肠道菌群的良好平衡对整体健康非常重要。微生物代谢终产物占人体血液中代谢物的三分之一，在肠道稳态中发挥着重要作用，并对宿主代谢和健康产生影响 [ 18 ] [ 19 ] [ 23 ]。

色谱图（图 1-3）显示了三种不同胃肠道微生物在发酵 18 小时后分别产生的代谢物的质谱图（μg/ml）。共检测和评估了 14 种属于有机酸、短链脂肪酸 (SCFA) 和中链脂肪酸 (MCFA) 家族的不同代谢物。大肠杆菌、芽孢杆菌

图 1。大肠杆菌在 Otili 中产生的酸的数量和类型。

图 2。嗜酸乳杆菌在发酵的 Otili 中产生的有机酸量。

图 3。由枯草芽孢杆菌发酵的 Otili 中产生的酸的数量和类型。

枯草杆菌和嗜酸乳杆菌能够产生丁酸、己酸（己酸）、十二烷酸（月桂酸）、9-十六烷酸（棕榈酸）、十六碳烯酸（棕榈酸）。而辛酸（辛酸）和二十二碳烯酸（芥酸）仅在大肠杆菌和嗜酸乳杆菌中检测到 10.94 µg/ml。由这三种发酵微生物发酵的样品产生的脂肪酸量最大，以十六烯酸的形式出现在 27.26 - 27.39 µg/ml 的范围内。形成的第二高代谢物是丁酸，在嗜酸乳杆菌发酵培养基中最高，值为 19.84 µg/ml，而丁酸最低值在枯草芽孢杆菌培养基中，为 21.31 µg/ml。此外，在三种微生物发酵的 Otili 中也发现了月桂酸，其值为 17.85 µg/ml。己酸在嗜酸乳杆菌和大肠杆菌中的含量非常高，为 20.87 µg/ml，而在枯草芽孢杆菌中的含量最低，为 19.02 µg/ml。Bacillus subtilis发酵的Otili中未检出辛酸，但E.coli和Lactobacillus acidophilus发酵Otili的辛酸值均为18.06 µg/ml。在嗜酸乳杆菌和发酵 Otili 的大肠杆菌中均未检测到癸酸，但在枯草芽孢杆菌发酵的 Otili 中检测到癸酸，其值为 21.31 µg/ml。然而，仅在枯草芽孢杆菌发酵的 Otili 中发现了十三烷酸和十七烷酸。己酸在嗜酸乳杆菌和大肠杆菌中的含量非常高，为 20.87 µg/ml，而在枯草芽孢杆菌中的含量最低，为 19.02 µg/ml。Bacillus subtilis发酵的Otili中未检出辛酸，但E.coli和Lactobacillus acidophilus发酵Otili的辛酸值均为18.06 µg/ml。在嗜酸乳杆菌和发酵 Otili 的大肠杆菌中均未检测到癸酸，但在枯草芽孢杆菌发酵的 Otili 中检测到癸酸，其值为 21.31 µg/ml。然而，仅在枯草芽孢杆菌发酵的 Otili 中发现了十三烷酸和十七烷酸。己酸在嗜酸乳杆菌和大肠杆菌中的含量非常高，为 20.87 µg/ml，而在枯草芽孢杆菌中的含量最低，为 19.02 µg/ml。Bacillus subtilis发酵的Otili中未检出辛酸，但E.coli和Lactobacillus acidophilus发酵Otili的辛酸值均为18.06 µg/ml。在嗜酸乳杆菌和发酵 Otili 的大肠杆菌中均未检测到癸酸，但在枯草芽孢杆菌发酵的 Otili 中检测到癸酸，其值为 21.31 µg/ml。然而，仅在枯草芽孢杆菌发酵的 Otili 中发现了十三烷酸和十七烷酸。发酵Otili的大肠杆菌和嗜酸乳杆菌的辛酸值为18.06 µg/ml。在嗜酸乳杆菌和发酵 Otili 的大肠杆菌中均未检测到癸酸，但在枯草芽孢杆菌发酵的 Otili 中检测到癸酸，其值为 21.31 µg/ml。然而，仅在枯草芽孢杆菌发酵的 Otili 中发现了十三烷酸和十七烷酸。发酵Otili的大肠杆菌和嗜酸乳杆菌的辛酸值为18.06 µg/ml。在嗜酸乳杆菌和发酵 Otili 的大肠杆菌中均未检测到癸酸，但在枯草芽孢杆菌发酵的 Otili 中检测到癸酸，其值为 21.31 µg/ml。然而，仅在枯草芽孢杆菌发酵的 Otili 中发现了十三烷酸和十七烷酸。

可以正确地确定，由大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌发酵的 Otili 在发酵 18 小时后，在 Otili 作为底物上含有相似的中链脂肪酸 (MCFA) 和短链脂肪酸 (SCFA) 作为其代谢产物。本研究中有价值的中链脂肪酸（MCFA）如己酸、月桂酸、棕榈酸、棕榈酸辛酸、芥酸的检测是对现有知识贡献的非常有趣的方面。例如，长期喂食 19% 棕榈酸和 56% 碳水化合物的饮食的大鼠显示出中枢神经系统对胰岛素分泌的控制以及对来自瘦素和胰岛素（参与体重调节的关键激素）的身体自然食欲抑制信号的抑制。24] [ 25 ] [ 26 ] [ 27 ]。还确定辛酸在治疗相关浓度下以电压和亚基依赖性方式作为非竞争性 α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸 (AMPA) 受体拮抗剂，这足以解释它的抗癫痫作用[ 28 ]。这直接抑制大脑中癸酸对兴奋性神经传递的抑制有助于 MCT 生酮饮食的抗惊厥作用。癸酸和 AMPA 受体拮抗剂药物作用于 AMPA 受体的不同位点，因此它们可能对 AMPA 受体产生协同作用，这表明生酮饮食可能具有协同作用 [ 29] [ 30 ] [ 31 ]。体外实验表明，包括月桂酸在内的一些脂肪酸可能是治疗痤疮的有用成分，但尚未进行临床试验来评估这种对人类的潜在益处 [ 30 ] [ 31 ]。月桂酸比许多其他脂肪酸更能增加血清总胆固醇。但大部分增加归因于高密度脂蛋白（HDL）（“好”血液胆固醇）的增加。因此，月桂酸的特点是“对总 HDL 胆固醇的影响比任何其他检查过的饱和或不饱和脂肪酸都更有利 [ 32 ] [ 33 ] [ 34] . 对实验动物的早期研究表明，芥酸在足够高的剂量下似乎对心脏有毒性作用 [ 35 ] [ 49 ]。尚未确定人类食用菜籽油与增加心肌脂质沉积症或心脏病之间的关联 [ 37 ] [ 38 ]。虽然有报告称长期使用含有芥酸和其他成分的洛伦佐油会产生毒性 [ 39 ]，但没有关于从饮食中摄入芥酸对人造成伤害的报告 [ 36 ] [ 40 ] [ 41] . 辛酸在商业上用于生产香料中使用的酯，也用于制造染料。辛酸是一种抗菌农药，用作乳制品设备、食品加工设备、啤酒厂、酿酒厂和饮料加工厂的商业食品处理机构的食品接触表面消毒剂。它还用作卫生保健设施、学校/学院、动物护理/兽医设施、工业设施、办公楼、娱乐设施、零售和批发场所、畜牧业场所、餐馆和酒店/汽车旅馆的消毒剂。此外，辛酸在苗圃、温室、花园中心用作除藻剂、杀菌剂、杀菌剂和除草剂。含有辛酸的产品被配制成可溶性浓缩液/液体和即用型液体 [42 ] [ 43 ]。为了使生长素释放肽对下丘脑产生饥饿刺激作用，辛酸必须与生长素释放肽 3 位的丝氨酸残基相连。为了引起饥饿，它必须酰化一个-OH基团。相同位置的其他脂肪酸对饥饿也有类似的影响。难怪，由于豆类的纤维和蛋白质含量，食用豆类可能会导致短期饱腹感[ 32 ]。

然而，嗜酸乳杆菌的丁酸产量最高；在本研究中检测到的值得注意的短链脂肪酸中，枯草芽孢杆菌的丁酸产量最少，而其他挥发性短链脂肪酸（如乳酸、乙酸和丙酸）则没有。18 小时的长发酵期可能是造成这种情况的原因，挥发性短链脂肪酸代谢物可能已用完或转化为检测到的 MCFA。这证实了 Marques 等人的意见，[ 44 ] 指出嗜酸乳杆菌参与发酵过程将增加丁酸的产量。罗素等人，[ 45] 指出，乳酸菌体外产生的乳酸被一些严格厌氧的丁酸盐产生细菌用于生产高浓度的丁酸。在进一步的研究中，他们提出丁酸盐产量的增加可能是由于丁酸盐生产者的直接刺激或间接影响，例如来自其他细菌群的发酵产物的代谢交叉喂养[ 46 ] [ 47 ]。丁酸是由膳食碳水化合物的细菌发酵在肠腔内产生的，对肠道功能有多种影响 [ 48] . 首先，丁酸是结肠细胞的首选能量来源。它影响细胞增殖、分化和凋亡。此外，丁酸具有充分证明的抗炎作用。抑制组蛋白脱乙酰酶活性，导致组蛋白过度乙酰化，从而抑制核因子 kappa B 活化，可能是一种解释。其次，有人提出丁酸通过增加粘蛋白和抗菌肽的产生来增强结肠防御屏障。第三，已经表明丁酸通过增加紧密连接蛋白的表达来降低肠上皮通透性 [ 49 ] [ 50 ] [ 51] . 因此，这些是治疗炎症性肠病的益生菌候选物。

4。结论

从这项研究中可以推断，某些微生物有助于分解豆类的难消化部分，从而提高 SCFA 和 MCFA 的产量。这些数据提供了初步证据，表明食用野生 Otili 等豆类饮食可以改善结肠的正常功能。

致谢

本项目部分由春节基金个人研究资助 2017-2018 届会议资助。为了开展这项研究，墨西哥克雷塔罗自治大学 Rocio Campos-Vega 教授（夫人）的宝贵鼓励得到了高度认可。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

参考

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